Мыши без PSD | Группа патч-кордов Цзилинь

Научные отчеты, том 5, Номер статьи: 16410 (2015) Цитировать эту статью

3293 Доступа

19 цитат

6 Альтметрика

Подробности о метриках

Убиквитинирование белков оказывает значительное влияние на различные аспекты развития и функций нейронов. Дорфин, также известный как Rnf19a, представляет собой убиквитинлигазу E3 RING-пальца, участвующую в развитии бокового амиотрофического склероза и болезни Паркинсона, но ее функции in vivo не изучены. Мы сообщаем здесь, что Дорфин является новым партнером по связыванию возбуждающего постсинаптического каркасного белка PSD-95. У мышей с мутацией Dorfin (Dorfin-/-) наблюдается сниженный нейрогенез у взрослых и повышенная долговременная потенциация в зубчатой извилине гиппокампа, но нормальная долговременная потенциация в области CA1. В поведении мыши Dorfin-/- демонстрируют нарушенное контекстуальное обусловливание страха, но нормальные уровни обусловленного страха, исчезновения страха, пространственного обучения и памяти, памяти распознавания объектов, пространственной рабочей памяти и разделения образов. Используя протеомный подход, мы также идентифицируем ряд белков, уровни убиквитинирования которых снижены в мозге Dorfin-/-. Эти результаты позволяют предположить, что Дорфин может регулировать нейрогенез взрослых, синаптическую пластичность и контекстуальную память о страхе.

Убиквитинирование белков регулирует различные аспекты развития и функций нейронов. Убиквитинлигазы E3, число которых исчисляется сотнями (~ 400–500 у мышей и людей), являются ключевыми компонентами системы убиквитинирования белков, играя важную роль в определении субстратной специфичности. Известно, что убиквитинирование белка приводит к деградации белка протеасомой 26S; однако накапливающиеся данные указывают на то, что он также выполняет дополнительные функции, такие как регуляция функции белка, транспортировка и субклеточная локализация, а также белок-белковые взаимодействия.

Убиквитинирование белков в нервной системе регулирует различные стадии развития нейронов, включая нейрогенез, миграцию, нейротогенез и синаптогенез1,2,3,4,5. Кроме того, считается, что убиквитинирование синаптических белков регулирует различные аспекты синаптической структуры, функции и пластичности. Известные субстраты синаптического убиквитинирования включают каркасные/адаптивные белки, рецепторы и сигнальные молекулы. Конкретные примеры и родственные лигазы E3 включают PSD-95–Mdm26, GKAP/SAPAP–Trim37,8, Shank/ProSAP7, SPAR–βTRCP9,10, AKAP79/1507, Homer-1a11, CaMKIIα12, липрин-α1–APC/C13,14. , эфексин-5-Ube3A15, Arc-Ube3a/Triad3a16,17, рецепторы AMPA (AMPARs)-Nedd4-1/RNF167/APC/C14,18,19,20,21,22, рецепторы NMDA (NMDARs)-Mib223, mGluR1α –Siah1A24,25, mGluR5–Siah1A25, рецепторы GABAA (субъединица γ2)26,27, Munc13-1–Fbxo4528, RIM1–SCRAPPER29 и Piccolo/фагот–Siah1A30.

Дорфин, убиквитинлигаза E3 RING-пальца, первоначально был идентифицирован как компонент тела XY сперматоцитов и центросом31. Дорфин (длина 840 аминокислот у мышей) содержит два домена RING, фланкирующих промежуточный домен (IBR), и два трансмембранных домена, хотя точная топология мембраны белка не установлена. Предыдущие исследования показали участие Дорфина в развитии семейного бокового амиотрофического склероза (БАС) и болезни Паркинсона32,33,34,35,36,37,38,39,40. Подтверждая нейропротекторную роль Дорфина при БАС, Дорфин убиквитинирует связанный с БАС мутантный белок SOD1 (супероксиддисмутаза 1)33 и, при сверхэкспрессии на мышиной модели семейного БАС, уменьшает количество мутантных белков SOD1 и подавляет неврологические фенотипы и двигательную активность. гибель нейрона40. Однако мало что известно о функциях Дорфина в нормальном мозге, включая его белок-белковые взаимодействия, белки-субстраты и функциональные последствия убиквитинирования белков-субстратов. Кроме того, функции Дорфина in vivo не были изучены с использованием методов нокаута генов.

В настоящем исследовании мы обнаружили, что Дорфин взаимодействует с обильным возбуждающим постсинаптическим каркасным белком PSD-95. У мышей Dorfin-/- наблюдается подавление нейрогенеза у взрослых и повышенная долговременная потенциация (LTP) в зубчатой извилине (DG), а также нарушение контекстуальной обусловленности страхом, что указывает на то, что Дорфин важен для нейрогенеза у взрослых, синаптической пластичности, а также обучения и памяти.

60%; ++, 30–60%;, +, 10–30%; −, no significant growth. (C) Pull down of full-length PSD-95 family proteins and control PDZ proteins (S-SCAM and GRIP2) by GST-Dorfin fusion proteins. GST-Dorfin (aa 834–840; WT and I840A), or GST alone, was used to bring down the indicated proteins expressed in HEK293T cells, followed by immunoblotting. (D,E) Coimmunoprecipitation of Dorfin with PSD-95 or SAP97. HEK293T cells doubly transfected with Flag-Dorfin (full length; WT or Δ3 missing the last three aa residues) and PSD-95, or SAP97, were immunoprecipitated (IP) with Flag antibodies and immunoblotted with the indicated antibodies./p>2.5 folds in the Dorfin−/− hippocampus relative to WT controls (see also Supplementary Table 1). Green circles indicate the proteins whose expression levels were tested by immunoblot of hippocampal lysates (see also Fig. 7H). (C–G) Dorfin forms a complex with five selected proteins from the list in Fig. 7B. HEK293 cells doubly expressing Myc-Dorfin and the indicated proteins were immunoprecipitated and immunoblotted with Myc or EGFP antibodies. Rab11b (C), NFM (D), PPP1CA (E), PPP1CB (F) and H2AFZ (G). Input, 5%. (H) Protein expression levels in the Dorfin−/− hippocampus (2–3 months) relative to those in WT controls, as determined by the immunoblot analysis of whole hippocampal lysates, the crude synaptosomal (P2) hippocampal fraction and microdissected whole DG lysates. (s.e.m., n = 3–6 for WT and KO hippocampi)./p>2.5 fold) in the Dorfin−/− brain relative to WT controls (Supplemental Table S1). These proteins could be classified into several functional groups, including adhesion molecules/extracellular matrix, adaptor/scaffolds, G protein-related proteins, phosphatases, proteases, enzymes and cell cycle/chromatin regulatory proteins (Fig. 7B)./p>2.5-fold in Dorfin−/− mice might provide some starting points. Indeed, many of these proteins are enriched in the postsynaptic density (PSD) and have been implicated in the regulation of excitatory synaptic transmission, synaptic plasticity and learning and memory (Supplemental Table S1). For example, Rab11a/b promotes translocation of recycling endosomes into dendritic spines and local exocytosis of GluA1 during LTP74,75,76,77. Therefore, Dorfin-dependent ubiquitination and degradation of Rab11a/b proteins would negatively regulate LTP. In addition, transgenic mice in which the signaling adaptors 14-3-3η and 14-3-3ζ are functionally inhibited by genetic expression of an inhibitor protein display reductions in synaptic content of NMDARs, NMDAR-mediated synaptic transmission, LTP and contextual fear conditioning78, suggesting that 14-3-3η and 14-3-3ζ positively regulate synaptic plasticity and learning and memory. Therefore, these functions may be suppressed by Dorfin-dependent 14-3-3 protein degradation./p>